脂肪干细胞辅助自体颗粒脂肪移植术研究进展(1)
在肿胀技术注射器吸脂和传统单纯自体颗粒脂肪注射填充移植[1]及脂肪组织源性干细胞(adipose derived stem cells，ADSCs)等[2]实验与临床研究基础上，2006年，Matsumoto等[3]提出ADSCs协同自体脂肪移植(cell-assist ed lipotransfer，CAL)概念，Yoshimura等[4]同期应用CAL成功进行了临床隆乳术；2008年，刘乃军等[5]在上述CAL基础上，提出干性CAL和湿性CAL概念，并应用湿性CAL技术成功进行了临床多量自体颗粒脂肪移植，临床获得明显提高[6]。现就ADSCs技术在临床颗粒脂肪注射移植方面的研究进展综述如下。
1 传统单纯干性和湿性颗粒脂肪注射移植方法
过去27年里，在湿性肿胀技术和注射器吸脂等基础上[7]，传统单纯自体颗粒脂肪注射移植方法分为(离心法)干性移植法[8-9](应用离心技术分离浓缩纯化颗粒脂肪)和(静置法)湿性移植法[10-11](不用离心技术而是采用自然静置悬浮反复漂洗析出水分等杂质纯化颗粒脂肪)；迄今两者仍是临床最常用的操作流程，公认为安全、有效的治疗方法，但有关颗粒脂肪注射移植术后存活率各家报道不一，且争议较大，要真正建立公认的临床规范标准化操作流程，仍需做出更多改进[12-13]，目前，我国自体颗粒脂肪注射填充移植技术已经进入世界先进行列。
2 自体ADSCs和SVF来源
近年研究证实，在人体吸脂颗粒脂肪悬液中获取的多向分化ADSCs是安全理想的自体细胞来源[14]，2007年，朱茗和高建华等[15]实验研究从成人脂肪抽吸物液体部分中分离得到大量可为脂肪组织工程所利用的ADSCs，其细胞量与脂质来源的量基本相同。2009年，Yoshimura等[16-17]实验研究吸脂抽吸物获得大量自体血管基质层片段细胞(stromal vascular fraction，SVF)。2010年，付冰川和高建华[18]等实验研究认为新鲜SVF与培养的ADSCs一样，可提高脂肪移植物存活率，前者操作更方便、省时、安全、高效，后者难以满足临床实际需要；其实，通过吸脂术获得颗粒脂肪内血管间质碎片(SVF)“微粒”含有多种类型多功能干细胞，其中就包括ADSCs，新鲜SVF直接添加到颗粒脂肪移植混合填充物中，不需额外处理，对颗粒脂肪移植混合填充物较少人工处理，更能改善脂肪细胞、ADSCs、SVF活性，额外人工处理纯化方法与脂肪细胞、ADSCs、SVF的细胞数量和活性无关，新鲜ADSCs和SVF可自然混合在颗粒脂肪移植填充物中，直接注射填充移植为脂肪组织工程所利用[19]；目前，虽很难证实新鲜ADSCs和SVF细胞准确数量及对体内移植颗粒脂肪在构建脂肪组织过程中确切辅助作用机制，关键是可避免体外离心浓缩及分离培养ADSCs和SVF过程中可能出现细胞基因变异问题[20]。关于ADSCs的应用，目前仍有许多重要问题有待探索解决，首先ADSCs在无免疫力的移植受体上表现出的肿瘤样无限增生特性，在进入临床实验前仍需寻找并建立合适动物模型进行长期观测以确定其移植后安全性；其次，在批量提取生产ADSCs过程中，如何保障细胞质量均一稳定仍然有待深入研究。
3 离心法与静置法对ADSCs和SVF的影响
对于吸脂抽吸物是否需要离心，迄今仍有很大争议，一些学者一直倡导采用自然静置悬浮漂洗或不漂洗法，另外一些学者则主张离心分离浓缩纯化法；目前临床还无公认合理的离心速度，Kurita 等[22]认为过快离心速度反而会破坏ADSCs完整性[21]；杨东运等认为低速离心并不能显著提高面部自体颗粒脂肪移植存活率；雷华等[23]认为大于等于600rpm均会损伤颗粒脂肪活性，建议颗粒脂肪移植慎用离心法，宜采用静置法，以最大程度保护颗粒脂肪免受损伤。2011年，Botti等[24]经长期临床验证认为注射移植的颗粒脂肪细胞其吸收、存活情况与脂肪离心分离浓缩纯化技术无关。研究表明，颗粒脂肪离心分离浓缩纯化方法与细胞数量和活性无关，注射器法吸脂吸出的颗粒脂肪不必进行离心和漂洗，宜采取自然静置悬浮法析出无用水分和杂质，最大程度保护颗粒脂肪混合填充物免受损伤[25]。
4 ADSCs和SVF体外提取分离培养过程及存在问题
ADSCs和SVF体外分离、提取、培养、制作、注射为一体的处理过程均需在高标准无菌手术室和净化室采用专用设备完成[26]。操作复杂繁琐成本高，ADSCs诱导液常含有与肿瘤发生转移有关的生长因子，且价格昂贵不易推广普及[27]。将离心浓缩纯化后颗粒脂肪与体外分离、培养的ADSCs和SVF细胞混合填充物复合同步移植，该项技术尚不成熟，目前仍处于进一步研究阶段。关于ADSCs和SVF的临床应用，目前仍有许多重要问题有待探索解决，《药品生产质量管理规范(2010年修订)》(简称新版药品GMP) 认为干细胞治疗需要严格按照药物研发的一般流程，包括研发筛选、临床前研究、临床阶段、新药批准上市几个主要阶段[28]，当前FDA和SFDA还未批准分离培养的ADSCs和SVF用于任何临床领域。目前为止，干性CAL技术主要是在体外细胞培养皿及试管中或动物身上进行实验研究，须经由严谨人体试验证实，不但要有稳定成活率和肯定疗效，而且还要有标准统一的质量控制和临床治疗规范化管理，只能允许有限的人体可忍受，不影响健康的副作用和无严重并发症发生，不改变受植区组织结构、不干扰受植区成像、不影响受植区恶性肿瘤筛查、不干扰受植区恶性肿瘤诊断，在这些条件完全具备后方可临床推广应用。干性CAL目前在临床治疗上并没有太大实际价值，进入临床应用前仍需慎之又慎，切勿盲目过早开展临床应用。进入临床试验前仍需寻找并建立合适动物模型进行长期观测以确定其移植后安全性，特别是目前还无法保证经离心后体外分离培养的ADSCs和SVF是否出现细胞基因变异瘤化问题；有研究显示，长时间培养的ADSCs可使免疫缺陷小鼠发生肿瘤[29-30]。目前尚无一安全稳定并行之有效的培养、诱导方式，以及在批量提取生产ADSCs和SVF过程中，如何保障细胞质量均一稳定性，有待进一步研究。
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1 传统单纯干性和湿性颗粒脂肪注射移植方法
过去27年里，在湿性肿胀技术和注射器吸脂等基础上[7]，传统单纯自体颗粒脂肪注射移植方法分为(离心法)干性移植法[8-9](应用离心技术分离浓缩纯化颗粒脂肪)和(静置法)湿性移植法[10-11](不用离心技术而是采用自然静置悬浮反复漂洗析出水分等杂质纯化颗粒脂肪)；迄今两者仍是临床最常用的操作流程，公认为安全、有效的治疗方法，但有关颗粒脂肪注射移植术后存活率各家报道不一，且争议较大，要真正建立公认的临床规范标准化操作流程，仍需做出更多改进[12-13]，目前，我国自体颗粒脂肪注射填充移植技术已经进入世界先进行列。
2 自体ADSCs和SVF来源
近年研究证实，在人体吸脂颗粒脂肪悬液中获取的多向分化ADSCs是安全理想的自体细胞来源[14]，2007年，朱茗和高建华等[15]实验研究从成人脂肪抽吸物液体部分中分离得到大量可为脂肪组织工程所利用的ADSCs，其细胞量与脂质来源的量基本相同。2009年，Yoshimura等[16-17]实验研究吸脂抽吸物获得大量自体血管基质层片段细胞(stromal vascular fraction，SVF)。2010年，付冰川和高建华[18]等实验研究认为新鲜SVF与培养的ADSCs一样，可提高脂肪移植物存活率，前者操作更方便、省时、安全、高效，后者难以满足临床实际需要；其实，通过吸脂术获得颗粒脂肪内血管间质碎片(SVF)“微粒”含有多种类型多功能干细胞，其中就包括ADSCs，新鲜SVF直接添加到颗粒脂肪移植混合填充物中，不需额外处理，对颗粒脂肪移植混合填充物较少人工处理，更能改善脂肪细胞、ADSCs、SVF活性，额外人工处理纯化方法与脂肪细胞、ADSCs、SVF的细胞数量和活性无关，新鲜ADSCs和SVF可自然混合在颗粒脂肪移植填充物中，直接注射填充移植为脂肪组织工程所利用[19]；目前，虽很难证实新鲜ADSCs和SVF细胞准确数量及对体内移植颗粒脂肪在构建脂肪组织过程中确切辅助作用机制，关键是可避免体外离心浓缩及分离培养ADSCs和SVF过程中可能出现细胞基因变异问题[20]。关于ADSCs的应用，目前仍有许多重要问题有待探索解决，首先ADSCs在无免疫力的移植受体上表现出的肿瘤样无限增生特性，在进入临床实验前仍需寻找并建立合适动物模型进行长期观测以确定其移植后安全性；其次，在批量提取生产ADSCs过程中，如何保障细胞质量均一稳定仍然有待深入研究。
3 离心法与静置法对ADSCs和SVF的影响
对于吸脂抽吸物是否需要离心，迄今仍有很大争议，一些学者一直倡导采用自然静置悬浮漂洗或不漂洗法，另外一些学者则主张离心分离浓缩纯化法；目前临床还无公认合理的离心速度，Kurita 等[22]认为过快离心速度反而会破坏ADSCs完整性[21]；杨东运等认为低速离心并不能显著提高面部自体颗粒脂肪移植存活率；雷华等[23]认为大于等于600rpm均会损伤颗粒脂肪活性，建议颗粒脂肪移植慎用离心法，宜采用静置法，以最大程度保护颗粒脂肪免受损伤。2011年，Botti等[24]经长期临床验证认为注射移植的颗粒脂肪细胞其吸收、存活情况与脂肪离心分离浓缩纯化技术无关。研究表明，颗粒脂肪离心分离浓缩纯化方法与细胞数量和活性无关，注射器法吸脂吸出的颗粒脂肪不必进行离心和漂洗，宜采取自然静置悬浮法析出无用水分和杂质，最大程度保护颗粒脂肪混合填充物免受损伤[25]。
4 ADSCs和SVF体外提取分离培养过程及存在问题
ADSCs和SVF体外分离、提取、培养、制作、注射为一体的处理过程均需在高标准无菌手术室和净化室采用专用设备完成[26]。操作复杂繁琐成本高，ADSCs诱导液常含有与肿瘤发生转移有关的生长因子，且价格昂贵不易推广普及[27]。将离心浓缩纯化后颗粒脂肪与体外分离、培养的ADSCs和SVF细胞混合填充物复合同步移植，该项技术尚不成熟，目前仍处于进一步研究阶段。关于ADSCs和SVF的临床应用，目前仍有许多重要问题有待探索解决，《药品生产质量管理规范(2010年修订)》(简称新版药品GMP) 认为干细胞治疗需要严格按照药物研发的一般流程，包括研发筛选、临床前研究、临床阶段、新药批准上市几个主要阶段[28]，当前FDA和SFDA还未批准分离培养的ADSCs和SVF用于任何临床领域。目前为止，干性CAL技术主要是在体外细胞培养皿及试管中或动物身上进行实验研究，须经由严谨人体试验证实，不但要有稳定成活率和肯定疗效，而且还要有标准统一的质量控制和临床治疗规范化管理，只能允许有限的人体可忍受，不影响健康的副作用和无严重并发症发生，不改变受植区组织结构、不干扰受植区成像、不影响受植区恶性肿瘤筛查、不干扰受植区恶性肿瘤诊断，在这些条件完全具备后方可临床推广应用。干性CAL目前在临床治疗上并没有太大实际价值，进入临床应用前仍需慎之又慎，切勿盲目过早开展临床应用。进入临床试验前仍需寻找并建立合适动物模型进行长期观测以确定其移植后安全性，特别是目前还无法保证经离心后体外分离培养的ADSCs和SVF是否出现细胞基因变异瘤化问题；有研究显示，长时间培养的ADSCs可使免疫缺陷小鼠发生肿瘤[29-30]。目前尚无一安全稳定并行之有效的培养、诱导方式，以及在批量提取生产ADSCs和SVF过程中，如何保障细胞质量均一稳定性，有待进一步研究。
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