人脐带血间充质干细胞研究近况及其在脂肪组织工程中的应用(1)
肖宏涛 综述，刘 毅 审校
人脐带血间充质干细胞(HUCBMSCs)是一种具有全能干细胞特点的细胞，是中胚层发育的早期细胞，其形态和生物学特点与骨髓源性间充质干细胞相似,具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等[1]。与骨髓相比，脐带血有更充足的来源，对供者无任何不良影响，其间充质干细胞更为原始，分化能力更强。因此脐带血间充质干细胞有可能替代骨髓间充质干细胞成为组织工程的重要种子细胞。脐带血间充质干细胞现已成为继骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞后又一受众多学者关注的热点，本文就脐带血间充质干细胞的研究近况及其在脂肪组织工程中的应用做一综述。
1脐带血间充质干细胞的发现及其生物学特征
1.1 脐带血间充质干细胞的发现：在脐带血中是否存在间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，研究初期有许多争议。Erices等[2]于2000年首次报道了从脐带血中分离培养出间充质样细胞，但在培养的29份标本中只有7份表现为间充质样细胞(Mesenehymal-like cells，MLC)，其免疫表型和功能特点与骨髓来源的MSCs极为类似，其余22份培养出的均为破骨样细胞，同时发现早产儿脐血中间充质干细胞的含量要较足月儿丰富。
, http://www.100md.com
Mareschi等[3]与上述意见不同，他们检测了35份骨髓和58份足月产脐血标本，以Percoll密度梯度离心分离单个核细胞，脐血的贴壁细胞很快衰退，表达CD45、CD14、CD31等造血及内皮细胞的标志，他们还检测了通常由MSCs分泌的两种细胞因子IL-6、IL-11和通常由单核-巨噬细胞分泌的TNFα、TGFβ的mRNA表达，结果显示脐血的贴壁细胞表达IL-6、TNFα和TGFβ，不表达IL-11，进一步证明脐血中缺乏MSCs，由此他们得出结论脐血中贴壁的单个核细胞表现出造血细胞的形态特点而不是MSCs。Yu等[4]培养了中期妊娠(16～28周)的胎儿血和足月分娩的脐带血，前者可以得到MSCs，而后者只得到异质性的贴壁细胞，表达CD45，表明属于造血细胞。Karen Bieback等[5]则通过实验证明了足月妊娠产妇脐带血中MSCs的存在，而且探究了MSCs的分离与脐血采集量、保存时间、单个核细胞数以及是否发生凝血和溶血有关。Lee等[6]应用梯度离心法从脐带血中分离到间充质干细(MSCs),并对其性质进行了初步鉴定，再次证实脐带血中存在MSCs。
, 百拇医药
随着研究脐带血间充质干细胞的学者越来越多，学者们的结论也逐渐趋于一致，脐带血中的确存在MSCs，但脐带血间充质干细胞所占的比例远较骨髓低得多(0.05～2.8/1.0×106脐带血单个核细胞，2～5/1.0×106骨髓单个核细胞)，脐带血MSCs连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，而且保持正常的核型和端粒酶活性。细胞周期研究表明，85%以上的MSCs处于G0/G1期，用流式细胞仪分析MSCs的RNA和DNA含量发现，脐带血MSCs有5%处于G0 期，而骨髓MSC有20%处于G0期。
1.2 脐带血间充质干细胞的生物学特性：近年来，对脐带血MSCs的研究已取得了重大进展，对其生物学特性也有了更深入的认识。一般认为在体外培养的脐带血MSCs的形态与骨髓MSCs相似，呈长梭形或纺锤形，只是体积稍小一些。有人还把脐带血来源的MSCs和骨髓来源的MSCs作了基因表达方面的对比，结论是：两者的基因表达除了因来源不同而导致的差别外，基本上是一致的[7]。脐带血MSCs另一个重要的生物学特性是其具有很强的增殖能力，Gang 等[8]将来源于人的新鲜脐血单个核细胞分离培养，发现传至第二代时即可见大量均一的成纤维状贴壁细胞(即MSCs)，大约86%的细胞处于G0/G1期。另据有关学者[9]统计6.6×105个脐带血原代MSCs在体外扩增10代后可获得9.9×108个细胞，扩增约1 500倍。这都充分表明了这些脐带血MSCs细胞确实具有很强的增殖潜能。
, 百拇医药
目前已有众多学者对脐带血MSCs表面抗原特性作了研究，证实脐带血MSCs均稳定地表达与MSCs相关联的CD13、CD29 、CD44 、CD90 、CD105 (SH2)及CD73 (SH3 、SH4)抗原(SH2、SH3和SH4为MSCs相关性抗原)，但不表达与造血及内皮细胞有关的CD14、CD34、CD45、CD31表面抗原[6，10-13]，这与骨髓来源的MSCs表面抗原完全一致[9，14]。脐带血MSCs所具有的多向分化潜能也是其重要的生物学特性之一。Lee等[15]用RT-PCR技术分析脐带血间充质干细胞，发现其表达多向分化基因：SDF21，NeuroD,血管内皮生长因子受体(VEGF2R1)等。同时许多试验[1，6，8]也验证了脐带血MSCs在不同的诱导条件下具有向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌细胞等分化的能力。
2人脐带血的采集方法及脐带血MSCs的分离、培养、纯化及扩增
2.1人脐带血的采集方法：脐带血的采集方法目前常用的是脐静脉穿刺法，选择无各种产科并发症的健康足月产妇，胎儿娩出后，在距胎儿5～7cm的脐带处进行双结扎，剪断脐带，消毒母侧脐带断端，用已消毒的注射器或负压采血袋(已用肝素抗凝，20U/ml)穿刺脐静脉抽取50ml左右脐带血液，4℃冰箱保存，不需要特殊处理，并于12h内进行分离。采集过程中必须严格无菌操作，避免按压子宫或挤压胎盘、脐带，并且注意将抗凝液充分混匀[16]。取血时间也要控制在胎儿娩出后5min之内。
, 百拇医药
2.2 脐带血间充质干细胞的分离：在分离脐带血MSCs方面目前尚无统一的方法，根据不同的实验条件可选用不同的方法。①密度梯度离心法：鉴于MSCs与其他细胞密度的差异，采用Pereoll或者Ficoll分离液来实现细胞间的分离。其中使用Pereol1分离液获得的MSCs大小均匀，纯度较应用Ficol1分离液获得的细胞纯度高，此方法简单有效，成本低廉；②贴壁筛选法：依据MSCs易贴附在塑料培养物上生长的特性将其与非贴壁细胞分离；③流式细胞仪分离法：根据间充质干细胞大小不同或细胞表面的一些特殊标志，采用流式细胞仪对其进行分选，该方法可获得较为纯化的间充质干细胞，但是分离过程对细胞活性影响较大，且实验条件要求较高，所需的标本量大，因此没有广泛的使用；④免疫磁珠分离法：原理是使用表面覆有特异性抗体的磁珠与间充质干细胞结合，再利用永久磁铁将间充质干细胞吸引分离出来。免疫磁珠分离法可以分离出纯度较高的细胞，但价格昂贵，难以推广；⑤单细胞克隆的方法[17]分离MSCs，实验条件要求高，所需标本量较大，不便于获得大量MSCs。此外，迟作华等[18]还采用了羟乙基淀粉沉淀法分离MSCs，此法优点是能减少体外处理步骤，减少处理过程中对细胞的损伤等，当前应用该方法的人还不多。目前最常用的方法是密度梯度离心法和贴壁筛选法联合应用[1]：先用密度梯度离心法从脐带血中分离出单个核细胞，再依据MSCs易贴附在塑料培养物上生长的特性，用贴壁筛选法将其从造血系统细胞中分离出来，从而获得纯度较高的MSCs。此法操作相对简单，可以避免仅使用密度梯度离心法分离出的细胞成分复杂的缺点，同时又可避免单用贴壁筛选法时标本中大量的红细胞占据MSCs所需贴壁空间的不足，是一种很实用的方法。, http://www.100md.com(肖宏涛 刘 毅)
人脐带血间充质干细胞(HUCBMSCs)是一种具有全能干细胞特点的细胞，是中胚层发育的早期细胞，其形态和生物学特点与骨髓源性间充质干细胞相似,具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等[1]。与骨髓相比，脐带血有更充足的来源，对供者无任何不良影响，其间充质干细胞更为原始，分化能力更强。因此脐带血间充质干细胞有可能替代骨髓间充质干细胞成为组织工程的重要种子细胞。脐带血间充质干细胞现已成为继骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞后又一受众多学者关注的热点，本文就脐带血间充质干细胞的研究近况及其在脂肪组织工程中的应用做一综述。
1脐带血间充质干细胞的发现及其生物学特征
1.1 脐带血间充质干细胞的发现：在脐带血中是否存在间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，研究初期有许多争议。Erices等[2]于2000年首次报道了从脐带血中分离培养出间充质样细胞，但在培养的29份标本中只有7份表现为间充质样细胞(Mesenehymal-like cells，MLC)，其免疫表型和功能特点与骨髓来源的MSCs极为类似，其余22份培养出的均为破骨样细胞，同时发现早产儿脐血中间充质干细胞的含量要较足月儿丰富。
, http://www.100md.com
Mareschi等[3]与上述意见不同，他们检测了35份骨髓和58份足月产脐血标本，以Percoll密度梯度离心分离单个核细胞，脐血的贴壁细胞很快衰退，表达CD45、CD14、CD31等造血及内皮细胞的标志，他们还检测了通常由MSCs分泌的两种细胞因子IL-6、IL-11和通常由单核-巨噬细胞分泌的TNFα、TGFβ的mRNA表达，结果显示脐血的贴壁细胞表达IL-6、TNFα和TGFβ，不表达IL-11，进一步证明脐血中缺乏MSCs，由此他们得出结论脐血中贴壁的单个核细胞表现出造血细胞的形态特点而不是MSCs。Yu等[4]培养了中期妊娠(16～28周)的胎儿血和足月分娩的脐带血，前者可以得到MSCs，而后者只得到异质性的贴壁细胞，表达CD45，表明属于造血细胞。Karen Bieback等[5]则通过实验证明了足月妊娠产妇脐带血中MSCs的存在，而且探究了MSCs的分离与脐血采集量、保存时间、单个核细胞数以及是否发生凝血和溶血有关。Lee等[6]应用梯度离心法从脐带血中分离到间充质干细(MSCs),并对其性质进行了初步鉴定，再次证实脐带血中存在MSCs。
, 百拇医药
随着研究脐带血间充质干细胞的学者越来越多，学者们的结论也逐渐趋于一致，脐带血中的确存在MSCs，但脐带血间充质干细胞所占的比例远较骨髓低得多(0.05～2.8/1.0×106脐带血单个核细胞，2～5/1.0×106骨髓单个核细胞)，脐带血MSCs连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，而且保持正常的核型和端粒酶活性。细胞周期研究表明，85%以上的MSCs处于G0/G1期，用流式细胞仪分析MSCs的RNA和DNA含量发现，脐带血MSCs有5%处于G0 期，而骨髓MSC有20%处于G0期。
1.2 脐带血间充质干细胞的生物学特性：近年来，对脐带血MSCs的研究已取得了重大进展，对其生物学特性也有了更深入的认识。一般认为在体外培养的脐带血MSCs的形态与骨髓MSCs相似，呈长梭形或纺锤形，只是体积稍小一些。有人还把脐带血来源的MSCs和骨髓来源的MSCs作了基因表达方面的对比，结论是：两者的基因表达除了因来源不同而导致的差别外，基本上是一致的[7]。脐带血MSCs另一个重要的生物学特性是其具有很强的增殖能力，Gang 等[8]将来源于人的新鲜脐血单个核细胞分离培养，发现传至第二代时即可见大量均一的成纤维状贴壁细胞(即MSCs)，大约86%的细胞处于G0/G1期。另据有关学者[9]统计6.6×105个脐带血原代MSCs在体外扩增10代后可获得9.9×108个细胞，扩增约1 500倍。这都充分表明了这些脐带血MSCs细胞确实具有很强的增殖潜能。
, 百拇医药
目前已有众多学者对脐带血MSCs表面抗原特性作了研究，证实脐带血MSCs均稳定地表达与MSCs相关联的CD13、CD29 、CD44 、CD90 、CD105 (SH2)及CD73 (SH3 、SH4)抗原(SH2、SH3和SH4为MSCs相关性抗原)，但不表达与造血及内皮细胞有关的CD14、CD34、CD45、CD31表面抗原[6，10-13]，这与骨髓来源的MSCs表面抗原完全一致[9，14]。脐带血MSCs所具有的多向分化潜能也是其重要的生物学特性之一。Lee等[15]用RT-PCR技术分析脐带血间充质干细胞，发现其表达多向分化基因：SDF21，NeuroD,血管内皮生长因子受体(VEGF2R1)等。同时许多试验[1，6，8]也验证了脐带血MSCs在不同的诱导条件下具有向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌细胞等分化的能力。
2人脐带血的采集方法及脐带血MSCs的分离、培养、纯化及扩增
2.1人脐带血的采集方法：脐带血的采集方法目前常用的是脐静脉穿刺法，选择无各种产科并发症的健康足月产妇，胎儿娩出后，在距胎儿5～7cm的脐带处进行双结扎，剪断脐带，消毒母侧脐带断端，用已消毒的注射器或负压采血袋(已用肝素抗凝，20U/ml)穿刺脐静脉抽取50ml左右脐带血液，4℃冰箱保存，不需要特殊处理，并于12h内进行分离。采集过程中必须严格无菌操作，避免按压子宫或挤压胎盘、脐带，并且注意将抗凝液充分混匀[16]。取血时间也要控制在胎儿娩出后5min之内。
, 百拇医药
2.2 脐带血间充质干细胞的分离：在分离脐带血MSCs方面目前尚无统一的方法，根据不同的实验条件可选用不同的方法。①密度梯度离心法：鉴于MSCs与其他细胞密度的差异，采用Pereoll或者Ficoll分离液来实现细胞间的分离。其中使用Pereol1分离液获得的MSCs大小均匀，纯度较应用Ficol1分离液获得的细胞纯度高，此方法简单有效，成本低廉；②贴壁筛选法：依据MSCs易贴附在塑料培养物上生长的特性将其与非贴壁细胞分离；③流式细胞仪分离法：根据间充质干细胞大小不同或细胞表面的一些特殊标志，采用流式细胞仪对其进行分选，该方法可获得较为纯化的间充质干细胞，但是分离过程对细胞活性影响较大，且实验条件要求较高，所需的标本量大，因此没有广泛的使用；④免疫磁珠分离法：原理是使用表面覆有特异性抗体的磁珠与间充质干细胞结合，再利用永久磁铁将间充质干细胞吸引分离出来。免疫磁珠分离法可以分离出纯度较高的细胞，但价格昂贵，难以推广；⑤单细胞克隆的方法[17]分离MSCs，实验条件要求高，所需标本量较大，不便于获得大量MSCs。此外，迟作华等[18]还采用了羟乙基淀粉沉淀法分离MSCs，此法优点是能减少体外处理步骤，减少处理过程中对细胞的损伤等，当前应用该方法的人还不多。目前最常用的方法是密度梯度离心法和贴壁筛选法联合应用[1]：先用密度梯度离心法从脐带血中分离出单个核细胞，再依据MSCs易贴附在塑料培养物上生长的特性，用贴壁筛选法将其从造血系统细胞中分离出来，从而获得纯度较高的MSCs。此法操作相对简单，可以避免仅使用密度梯度离心法分离出的细胞成分复杂的缺点，同时又可避免单用贴壁筛选法时标本中大量的红细胞占据MSCs所需贴壁空间的不足，是一种很实用的方法。, http://www.100md.com(肖宏涛 刘 毅)